用于黑素瘤疾病进展的生物标记的制作方法

来自 : www.xjishu.com/zhuanli/52/2015 发布时间：2021-03-24

本发明尤其涉及用于治疗黑素瘤的治疗剂，在罹患黑素瘤的受试者中诊断转移风险增加的方法，治疗这样的受试者的方法，诊断试验和试剂盒。更特别地，在某些实施方案中，本发明涉及通过在得自受试者的组织样本中测定Ambra-1和兜甲蛋白的表达，鉴定罹患黑素瘤的受试者是否具有增加的转移风险。发明背景黑素瘤仅占所有皮肤癌的2.3%，但它是最威胁生命的形式，造成超过75%的皮肤癌死亡。由于全世界的发病率上升，皮肤黑素瘤目前已是一个主要的公共健康问题，仅在英国每年有超过2000个体的生命要求索赔。增加的速率高于任何其它癌症，并且已经把它比作一种流行病。一些增加可能是由于监视和早期检测的改进以及诊断标准的修改，然而，认为相当比例的增加是真实的。增加与阳光暴露上升和/或使用人工日光浴增加有关。欧洲人年龄-标准化发病率在过去30年对于女性增加4-倍和对于男性增加7-倍。黑素瘤现在是英国第五位最常见的癌症，占全部新癌症病例的4%。死亡率也增加，但死亡率不成比例地少于发病率，以致死亡与患者病例的比例在过去50年中稳步下降。即使如此，全世界黑素瘤每年总共有几乎50,000人死亡。影响预后的因素包括肿瘤的厚度(毫米)(布雷斯洛深度(Breslow\'sdepth))，与皮肤结构相关的深度(克拉克水平(Clarklevel))，黑素瘤的类型，转移的存在和溃烂的存在。与非-溃烂的肿瘤比较，在诊断时显示表皮溃烂的原发性黑素瘤预示增加的转移率和较差的后果。然而，溃烂的基础生物学仍然是神秘的。早期(AJCC1a或1b期)黑素瘤的治疗涉及围绕黑素瘤的组织的去除，称为宽泛的局部切除。这通常接着是患者1-5年期内疾病复发的定期检查。疗法，例如化学疗法，不给予早期黑素瘤患者。对于患有较厚肿瘤的患者(AJCC2a、2b或2c期)，宽泛的局部切除可能紧随一个前哨淋巴结活检，以确定疾病是否已经扩散到淋巴结。如果已经扩散，则淋巴结切除可执行。帮助防止黑素瘤返回或蔓延的手术后的治疗被称为辅助疗法。辅助疗法可以是化学疗法或生物学疗法(如干扰素治疗)。然而，辅助疗法一般仅提供给患有2期黑素瘤的患者作为临床试验的一部分。化学疗法、放射疗法和/或生物学疗法可被用来在已切除2期肿瘤的患者中治疗复发中的黑素瘤，以帮助进一步控制局限于淋巴结(3期)的患病患者的转移进展，或缩小晚期转移疾病患者(AJCC4期)的黑素瘤以减轻症状。仍有改进罹患黑素瘤患者的治疗和降低进展至转移的可能性的需求。本发明的一些实施方案的目的是至少部分地减轻一些现有技术中确定的问题。本发明的某些实施方案的概述依据本发明的第一个方面，提供一种用于治疗受试者的黑素瘤的治疗剂，其中所述受试者已被鉴定为具有在得自受试者的组织样本中Ambra-1和兜甲蛋白的表达降低或丧失。Ambra-1(Beclin-1调节的自噬蛋白1中的活化分子)是含有WD40的蛋白。研究已涉及在自噬控制中的Ambra-1，其中Ambra-1被认为作为蛋白-蛋白相互作用平台发挥功能。Ambra-1在自噬过程中的主要作用被认为是作为Beclin-1/VPS34复合物的成员，其在自噬的成核阶段期间参与富含PI3K的膜的形成。研究已提出Ambra-1也直接作为自噬活性的上游调节剂起作用。Ambra-1的氨基酸序列在附图中示出。Ambra-1已另外地显示在细胞分化中发挥作用。在小鼠模型中Ambra-1的功能失活导致具有严重的神经管缺陷的子宫内致死性，伴有自噬损伤和不平衡的细胞增殖。相反，Ambra-1的过度表达已显示降低神经组织中的细胞增殖率，因此支持其作为表皮增殖的关键参与者的作用。兜甲蛋白是富含甘氨酸-丝氨酸-半胱氨酸的蛋白，其在人类中由LOR基因编码。LOR基因是称为表皮分化复合物的染色体1上的基因簇的部分。这些基因参与外层皮肤(表皮)，特别是其坚韧的外表面(角质层)的形成和维持。角质层，其在称为角质化的过程中形成，提供身体及其环境之间的一个坚固的屏障。角质层的每个细胞，称为角质细胞，被称为角质化包膜(CE)的蛋白质外壳围绕。兜甲蛋白是角质化包膜的主要蛋白质。兜甲蛋白和包膜的其它成分之间的连接将角质细胞保持在一起并帮助赋予角质层其强度。兜甲蛋白的氨基酸序列在附图中示出。依据本发明的第二方面，提供一种用于治疗受试者的黑素瘤的治疗剂，其中所述受试者已被鉴定为具有增加的转移风险，其中风险增加的鉴定通过以下来确定：(i)测定Ambra-1和兜甲蛋白在得自受试者的组织样本中的表达，其中组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的组织；和(ii)比较在(i)中获得的表达与参考组织或由此获得的水平；其中与参考组织或水平比较，Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达降低，或Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达丧失，表示受试者的转移风险增加。应该意识到，在一些实施方案中，可能不需要Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达与参考的比较，例如其中表达的丧失被确定时。因此，在某些实施方案中，Ambra-1和兜甲蛋白的表达的降低或丧失是明显的，没有必要将表达与参考组织比较。依据本发明的第三方面，提供一种用来在罹患黑素瘤和已被鉴定为正处于进展至转移的风险增加的受试者中预防或减少进展至转移的可能性的治疗剂，其中所述鉴定包括确定受试者具有Ambra-1和兜甲蛋白在受试者的覆盖原发性黑素瘤的角化细胞中的表达降低或丧失。依据本发明的第四方面，提供一种测定患有黑素瘤的受试者是否具有增加的转移风险的体外方法，该方法包括：(i)测定Ambra-1和兜甲蛋白在得自受试者的组织样本中的表达，其中组织样本包括覆盖原发性黑素瘤的组织；和(ii)比较在(i)中获得的表达与参考组织或由此获得的水平，其中与参考组织或水平比较，Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达降低或Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达丧失，表示转移风险增加。依据本发明的第五方面，提供一种确定用于罹患黑素瘤的受试者的治疗方案的方法，该方法包括：a)从受试者获得组织样本，其中组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的组织；b)测定Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达；c)比较在(b)中获得的表达与参考组织或由此获得的水平，和d)(i)如果Ambra-1和兜甲蛋白的表达是正常的或增加，则遵循正常认可的护理途径，或(ii)如果Ambra-1和兜甲蛋白的表达降低或丧失，则用系统性抗-癌治疗方案治疗受试者。依据本发明的第六方面，提供一种治疗罹患黑素瘤的受试者的方法，该方法包括给予受试者治疗剂，其中受试者已被鉴定为具有在得自受试者的组织样本中Ambra-1和兜甲蛋白的表达降低或丧失。依据本发明的第七方面，提供一种治疗罹患黑素瘤的受试者的方法，该方法包括：(i)测定Ambra-1和兜甲蛋白在得自受试者的组织样本中的表达，其中组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的组织；(ii)比较在(i)中获得的表达与参考组织或由此获得的水平，和如果与参考组织或水平比较，Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达有降低，或Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达丧失，则给予受试者治疗剂。依据本发明的第八方面，提供用于预测罹患黑素瘤的受试者转移风险增加的体外试验，该试验包括：(i)使得自受试者的组织样本与对Ambra-1特异性的第一配体接触，其中Ambra-1的存在产生一种Ambra-1-配体复合物；(ii)使组织样本与对兜甲蛋白特异性的第二配体接触，其中兜甲蛋白的存在产生一种兜甲蛋白-配体复合物；和(iii)检测和/或定量Ambra-1-配体复合物和兜甲蛋白-配体复合物。受试者可以是罹患黑素瘤的人或动物。在一些实施方案中，受试者是人患者。在一些实施方案中，受试者已经被诊断为患有黑素瘤。在一些实施方案中，受试者正罹患AJCC1期、2期、3期或4期黑素瘤。在一些实施方案中，受试者正罹患AJCC1a期、1b期、2a期、2b期或2c期黑素瘤。在一些实施方案中，受试者正罹患AJCC1a期或1b期黑素瘤。在一些实施方案中，在此描述的方法还包括依据AJCC分期标准，对得自受试者的组织样本中存在的原发性肿瘤分期。对早期黑素瘤的治疗通常包括手术以切除肿瘤。疗法一般用来控制疾病晚期转移的扩散，此时预后通常是差的。鉴定处于疾病的早期但面临高的或增加的转移风险的那些受试者将便利地使治疗能够相应地定制。例如，疗法可比它可能正常地给予时更快地给予那些受试者，从而抑制、预防或延迟转移并改进那些受试者的预后。因此，在一些实施方案中，受试者在鉴定之前不符合用治疗剂治疗。在某些实施方案中，与治疗黑素瘤的现有技术方法比较，可在较早或较少进展的阶段向受试者提供治疗方案，在现有技术方法中患者当他们正罹患AJCC3期或4黑素瘤，或在AJCC2或3期黑素瘤后疾病复发时，仅用治疗剂治疗。在一些实施方案中，受试者患有溃烂性黑素瘤。出乎意料地，本发明人已鉴定Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达水平和黑素瘤受试者中转移的可能性之间的相关性。特别是，认为Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达水平降低，或表达丧失，表示受试者具有增加的转移风险。如在此所用的，Ambra-1和兜甲蛋白的表达的降低或丧失将被理解为意指Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达水平少于各自的参考水平的约75%。在一些实施方案中，Ambra-1和兜甲蛋白的表达的降低将被理解为意指Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达水平是各自的参考水平的从约25至约75%。在一些实施方案中，Ambra-1和兜甲蛋白的表达的丧失将被理解为意指Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达水平少于相关蛋白的参考水平的约25%。正常表达被理解为意指Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达大于各自的参考水平的约75%。因此，在一些实施方案中，Ambra-1在组织样本中的表达水平是从约25%至约75%的参考水平。在一些实施方案中，Ambra-1的表达水平不大于75%，不大于70%，不大于60%，不大于50%，不大于40%或不大于30%的参考水平。在一些实施方案中，兜甲蛋白在组织样本中的表达水平是从约25%至约75%的参考水平。在一些实施方案中，兜甲蛋白的表达水平不大于75%，不大于70%，不大于60%，不大于50%，不大于40%或不大于30%的参考水平。在一些实施方案中，在组织样本中基本上没有Ambra-1和/或兜甲蛋白的表达。在某些实施方案中，Ambra-1和/或兜甲蛋白的表达少于25%。在一些实施方案中，转移风险增加意指7-年无转移(也称为“无疾病”)存活率少于50%，例如少于40%，例如少于30%，例如少于20%，例如少于10%或例如少于5%。因此，Ambra-1和兜甲蛋白可被考虑为黑素瘤疾病进展为转移的生物标记。因此，本发明的实施方案可被考虑为提供用于预测受试者的黑素瘤进展为转移的方法。在一些实施方案中，本发明还提供Ambra-1和兜甲蛋白在包含覆盖原发性黑素瘤的组织的组织样本中作为黑素瘤疾病进展为转移的预兆性生物标记的用途。适当地，Ambra-1和兜甲蛋白可被考虑为用于将患有黑素瘤的受试者划分成更可能发生转移的那些和不太可能发生转移的那些的生物标记。有利地，本发明的某些实施方案的方法帮助鉴定最可能从用治疗剂治疗受益的患有黑素瘤的受试者。适当地，本发明的某些实施方案可使得能够用治疗剂治疗否则不符合用治疗剂治疗的患者。并非测定在肿瘤本身中的生物标记的表达水平，本发明的某些实施方案的方法包括测定Ambra-1和兜甲蛋白在覆盖原发性黑素瘤的组织中的表达水平。不受理论的束缚，认为这些蛋白的表达减少或丧失可表示覆盖肿瘤的表皮和肿瘤下面的内衬血管或淋巴管的内皮组织的分解，提示癌细胞可以能够，或可能已经从原发性肿瘤迁移。这样的迁移可导致转移。在一些实施方案中，组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的组织。在一些实施方案中，组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的肿瘤周围的表皮的至少一部分。在一些实施方案中，组织样本还包含邻近原发性黑素瘤的部分正常组织。在一些实施方案中，部分正常组织提供一种参考。适当地，参考是参考组织和/或提供Ambra-1和兜甲蛋白的参考水平。在一些实施方案中，所述方法包括测定Ambra-1和兜甲蛋白在表皮中的表达水平。角化细胞是组成约90%的表皮的细胞。因此，在一些实施方案中，组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的角化细胞。适当地，受试者可被鉴定为处于增加的转移风险中，其中所述鉴定包括测定受试者具有Ambra-1和兜甲蛋白在受试者的覆盖原发性黑素瘤的角化细胞中的表达降低或丧失。在一些实施方案中，组织样本先前已得自受试者，以致采样本身不形成本发明的方法的一部分。样本可在本方法之前即刻，或在本方法之前数小时、数天或数周已经获得。在其它实施方案中，本发明的方法可另外地包括从受试者获得组织样本的步骤。适当地，将Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达与一个或多个参考比较。适当地，参考是组织，或由此获得的表达水平。在一些实施方案中，参考包含为正常组织的特征的Ambra-1和兜甲蛋白表达的水平。适当地，兜甲蛋白和Ambra-1的参考水平可通过测定兜甲蛋白和Ambra-1在参考组织中的表达获得。在一些实施方案中，兜甲蛋白和Ambra-1在参考组织中的表达水平通过视觉或自动评估测定。在一些实施方案中，为正常组织的特征的Ambra-1和兜甲蛋白表达的参考水平通过测定在得自一个或多个(如一群)健康受试者的组织样本中的表达水平获得。在一些实施方案中，参考组织包含正常组织。在一些实施方案中，正常组织包含来自不包括原发性黑素瘤的部位的表皮。在一些实施方案中，参考组织(或由此获得的水平)是内部参考(即得自受试者)。在一些实施方案中，参考组织是得自邻近原发性黑素瘤的部位的正常组织。在其它实施方案中，参考组织得自远离原发性黑素瘤的受试者的部位。因此，在一些实施方案中，参考水平是兜甲蛋白和/或Ambra-1在正常组织中的表达水平。参考组织适当地取自正常表皮，而参考水平是在正常表皮的角化细胞中的表达水平。Ambra-1和/或兜甲蛋白在参考组织中的表达，例如生成参考水平，可使用本文描述的方法确定。适当地，组织样本可以是得自受试者的活组织检查，或其切片。组织样本，例如活组织检查，可通过本领域技术人员已知的各种采样方法，包括穿孔活组织检查，刮削活组织检查，宽泛的局部切除和其它手段获得。适当地，肿瘤样本从原发性黑素瘤已从受试者切除的手术部位取得。适当地，组织样本可以是冷冻的、新鲜的、固定的(如福尔马林固定的)、离心分离的，和/或包埋的(如石蜡包埋的)等。组织样本可经受或已经受各种熟知的收集后制备和贮藏技术(如，核酸和/或蛋白提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心分离等)，然后评价样本中的Ambra-1和兜甲蛋白的量。同样，活组织检查也可经受收集后制备和贮藏技术，如固定。组织样本，或其切片，可固定在固体载体，例如载玻片上。在一些实施方案中，测定Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达包括测量存在于组织样本中的每种蛋白的水平。这可通过本领域技术人员已知的方法实现。这样的方法包括免疫分析，例如免疫组织化学、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀反应，随后的SDS-PAGE和免疫细胞化学等。因此，在一些实施方案中，测定Ambra-1和兜甲蛋白的表达水平包括进行试验。在一些实施方案中，测定是体外试验。在一些实施方案中，受试者通过以一种方法测定Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达，被鉴定为具有增加的转移风险，所述方法包括：使组织样本与对Ambra-1特异性的第一配体接触，其中Ambra-1的存在产生一种Ambra-1-配体复合物；使组织样本与对兜甲蛋白特异性的第二配体接触，其中兜甲蛋白的存在产生一种兜甲蛋白-配体复合物；和检测和/或定量Ambra-1-配体复合物和兜甲蛋白-配体复合物。在一些实施方案中，第一配体包含抗-Ambra-1抗体或适体。在一些实施方案中，抗-Ambra-1抗体或适体特异性地结合于具有在SEQIDNO.1中所示的序列的蛋白。在一些实施方案中，第二配体包含抗-兜甲蛋白抗体或适体。在一些实施方案中，抗-兜甲蛋白抗体或适体特异性地结合于具有在SEQIDNO.2中所示的序列的蛋白。人Ambra-1和兜甲蛋白的氨基酸序列作为例子在此提供，然而，应意识到这些序列的变体可以是已知的或被鉴定的。在一些实施方案中，受试者是非-人哺乳动物。因此还应该意识到，在此提及Ambra-1(或SEQIDNO.1)和兜甲蛋白(或SEQIDNO.2)包括其非人同系物的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二配体包含检测部分(如荧光标记)。检测部分能够直接或间接检测和/或量化形成的复合物。在一些实施方案中，第一配体包含第一检测部分和第二配体包含第二检测部分。第一检测部分可以是与第二检测部分相同的，或它可以是不同的。在一些实施方案中，所述方法包括使组织样本的第一部分或切片与第一配体接触，并使组织样本的第二部分或切片与第二配体接触。这特别适合于其中第一检测部分与第二检测部分是相同的实施方案。在一些备选的实施方案中，所述方法包括使组织样本，或其部分或切片，与第一配体接触，和使相同的组织样本，或其部分或切片，与第二配体接触。有可能在相同的样本，或其部分或切片中检测和/或量化Ambra-1-配体复合物和兜甲蛋白-配体复合物二者，特别地如果第一和第二检测部分是不同的话。适当地，第一和/或第二配体可与一种或多种捕获剂组合使用。因此，在一些实施方案中，检测和/或定量Ambra-1-配体复合物和兜甲蛋白-配体复合物的步骤包括使组织样本(或其切片或部分)与至少一种捕获剂接触。适当地，特异性地结合于第一配体的第一捕获剂可被用来检测和/或量化Ambra-1-配体复合物，而特异性地结合于第二配体的第二捕获剂可被用来检测和/或量化兜甲蛋白-配体复合物。或者，可使用能够特异性地结合于第一和第二配体二者的单一捕获剂。在一些实施方案中，捕获剂包含结合部分和检测部分。在一些实施方案中，结合部分是特异性地结合于第一和/或第二配体的第二抗体。例如，结合部分可以是能够结合于用作第一和第二配体的一次抗体的通用抗-IgG抗体。在一些实施方案中，该方法还包括一个或多个洗涤步骤以除去未结合的第一和第二配体和任选的未结合的捕获剂。在一些特定实施方案中，提供一种预测罹患黑素瘤的受试者的转移风险增加的体外试验，所述试验包括：使得自受试者的组织样本的第一部分与对Ambra-1特异性的第一配体接触，其中Ambra-1的存在产生一种Ambra-1-配体复合物；使组织样本的第二部分与对兜甲蛋白特异性的第二配体接触，其中兜甲蛋白的存在产生一种兜甲蛋白-配体复合物；洗涤组织样本的第一和第二部分以除去未结合的配体；使组织样本的第一和第二部分接触捕获剂，其中捕获剂包含对第一和第二配体特异性的检测部分和结合部分；洗涤组织样本的第一和第二部分以除去未结合的捕获剂；和检测和/或定量组织样本的第一和第二部分中存在的捕获剂。适当地，合适的检测部分选自荧光部分、发光部分、生物发光部分、放射性物质、比色部分、具有合适的可检测特性的纳米粒子、发色部分、生物素或酶。合适的荧光部分包括荧光蛋白(例如藻红蛋白(PE)、多甲藻素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)和别藻蓝蛋白(APC))、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明(Rs)和蓝色素(Cys))、荧光串联复合物(例如别藻蓝蛋白-蓝色素7(APC-Cy7)、多甲藻素-叶绿素-蛋白复合物-蓝色素5(PerCP-cy5)和藻红蛋白-得克萨斯红(PE-TexasRed))，和纳米晶体(例如QDot525、QDot545和QDot625)。Ambra-1-配体和兜甲蛋白-配体复合物的存在可使用荧光显微镜，经由使用荧光配体或包含荧光检测部分的捕获剂检测。在其中检测部分包含酶的实施方案中，Ambra-1-配体复合物和兜甲蛋白-配体复合物的存在可通过检测和/或定量由酶催化的底物反应的反应产物检测和/或量化。在这些实施方案中，该方法还包括加入酶的底物和检测和/或定量酶在底物上进行反应的产物。例如，反应可导致有色沉淀的产生，其将使用光学显微镜检测。合适的酶包括，例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶的发色底物是PNPP(对硝基苯基磷酸二钠盐)。PNPP产生一种在405nm处吸光的黄色水溶性反应产物。辣根过氧化物酶的发色底物包括ABTS(2,2\'-连氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)，其产生一种绿色反应产物；OPD(盐酸邻苯二胺)，其产生一种橙黄色反应产物；和当检测HRP时，TMB(3,3\',5,5\'-四甲基对二氨基联苯)可溶性底物产生一种蓝色。其它合适的酶-底物组合，检测Ambra-1-配体和兜甲蛋白-配体复合物的方法，和合适的检测部分将是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，第一和/或第二配体或捕获剂被固定在固相表面，例如微阵列、载玻片、孔或珠上。在一些实施方案中，Ambra-1和兜甲蛋白的表达经视觉评估检测和/或定量，例如，微阵列。在其它实施方案中，Ambra-1和兜甲蛋白的表达通过自动玻片扫描仪检测和/或定量。依据本发明的第九个方面，提供一种预测罹患黑素瘤的受试者发生转移的风险增加的试剂盒，所述试剂盒包含：对Ambra-1特异性的第一配体；和对兜甲蛋白特异性的第二配体。在一些实施方案中，试剂盒还包含使用试剂盒以预测罹患黑素瘤的受试者转移的风险的用法说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含至少一种捕获剂。适当地，捕获剂可包含对第一和/或第二配体特异性的检测部分和结合部分。在一些实施方案中，第一和/或第二配体和/或捕获剂包含作为检测部分的酶，和试剂盒还包含酶的底物。适当地，试剂盒还可包含一个或多个另外的成分例如为进行体外试验必需的试剂和/或设备，如缓冲剂、固定剂、洗涤溶液、封闭试剂、稀释剂、发色体、酶、底物、试管、测定板、吸液管等。本发明的某些实施方案的试剂盒可有利地用来进行本发明的某些实施方案的方法并可用于各种应用，例如用于诊断领域或作为一种研究工具。要意识到试剂盒的各部分可被单独包装在小瓶中或组合包装在容器或多-容器单位中。适当地，试剂盒的生产遵循本领域技术人员已知的标准程序进行。在一些实施方案中，在受试者被鉴定为具有在组织样本中Ambra-1和兜甲蛋白的表达降低或丧失后不超过12周，不超过10周，不超过6周，不超过4周，不超过2周或不超过1周，给予受试者治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。任何可获得的、合适的化学治疗剂可给予受试者。如在此所用的，“化学治疗剂”意指任何可用来治疗癌症的治疗剂，并涵盖小分子以及生物制剂，例如抗体。在一些实施方案中，化学治疗剂选自达卡巴嗪(DTIC)、替莫唑胺、Nab-紫杉醇、紫杉醇、卡莫司汀(BCNU)、顺铂、卡铂、长春碱、白介素2、α干扰素、抗体(如伊匹木单抗、抗-PD1抗体)和B-Raf抑制剂(如维罗非尼(vemurafenib)、达帕菲尼(dabrafenib))。给予治疗剂的非-限制性途径包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、皮内、鼻内或支气管内给予(例如如通过吸入进行的)。在一些实施方案中，治疗剂经胃肠外给予，如静脉内。治疗剂可经此给予的常见给药模式包括，例如，在规定的时间内作为推注剂量或作为输注给予。治疗剂可以以有效预防、抑制或延迟转移的发生的量给予。用于给定的受试者和治疗剂的合适的剂量和剂量方案可使用各种不同方法，例如身体-表面积或身体-重量，或依据专题文献和/或各个医院的协议确定。剂量还可在考虑了受试者的中性粒细胞计数、肾和肝功能，和任何以前的对治疗剂的副作用历史后调整。剂量也可根据治疗剂是否单独或组合使用而不同。技术人员将认识到其它给药模式、治疗剂的剂量和治疗方案可由治疗医师依据本领域已知的方法确定。本发明的某些实施方案提供一种确定用于罹患黑素瘤的受试者的治疗方案的方法，该方法包括：a)从受试者获得组织样本，其中组织样本包含覆盖原发性黑素瘤的组织；b)测定Ambra-1和兜甲蛋白在组织样本中的表达；c)比较在(b)中获得的表达与参考组织或由此获得的水平，和d)(i)如果Ambra-1和兜甲蛋白的表达是正常的或增加，则遵循正常认可的护理途径，或(ii)如果Ambra-1和兜甲蛋白的表达降低或丧失，则用系统性抗-癌治疗方案治疗受试者。“正常认可的护理途径”，如将为本领域技术人员已知的，将被理解为意指，在受试者上进行通过切除原发性黑素瘤留下的疤痕的较宽切除。较宽切除的尺寸将由临床医师或外科医师，基于原发性黑素瘤的布雷斯洛深度确定。正常认可的护理途径还可包括受试者持续至多5年的定期(如每3-12个月)临床评价。在一些实施方案中，其中原发性黑素瘤是2b或2c期，正常认可的护理途径还可包括在诊断时间内对受试者，从头到骨盆进行分期CT扫描。一些治疗中心提供全部2a、2b和2c期肿瘤的分期前哨淋巴结活组织检查。因此，在一些实施方案中，正常认可的护理途径还可包括进行前哨淋巴结活组织检查。在一些实施方案中，系统性抗-癌治疗方案包括给予受试者治疗剂。本发明的某些实施方案提供一种治疗罹患黑素瘤的受试者的方法。理想地，对鉴定为具有增加的转移风险的受试者尽可能快地治疗，以使发生转移的可能性最小化。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗方案在受试者中预防、抑制或延迟转移或降低转移的风险。在一些实施方案中，受试者在被鉴定为具有增加的转移风险后立即或不久被治疗。在一些实施方案中，用治疗剂治疗在切除原发性黑素瘤的手术后进行。在一些实施方案中，治疗方法或治疗方案还可包括以下一个或多个：该受试者的增强成像(如CT扫描、PET、MRI、X-射线)；讨论和/或提供，或进行前哨淋巴结活组织检查；部分或完整的淋巴切除术；在临床试验中包括该受试者；和放射疗法。某些实施方案的详细描述本发明的实施方案现在将仅仅通过举例的方式，并参考附图描述，其中：图1A-1D是显示Ambra-1在正常表皮中表达(图1A)和覆盖AJCCI期黑素瘤的肿瘤周围的表皮中表达(图1B-1D)的光学显微镜图像。比例尺：50µm。图2A-2C是显示兜甲蛋白在正常表皮中表达(图2A)，和覆盖AJCCI期黑素瘤的肿瘤周围的表皮中表达(图2B-2C)的免疫荧光显微镜图像。比例尺：50µm。图3A显示表皮Ambra-1在全部AJCC各期黑素瘤中表达的单变量分析。显示7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meiercurve)，在原发性黑素瘤表皮中Ambra-1表达无变化(顶线)、降低或缺乏Ambra-1表达(虚线)或溃烂性肿瘤(底线)。对数秩(Mantel-Cox)检验P 0.0001。DFS=100%无Ambra-1丧失，72.1%降低或缺乏Ambra-1，35.7%有溃烂。无丧失的Ambra-1和降低的/缺乏Ambra-1对数秩(Mantel-Cox)检验的直接分析P=0.0270，HR3.56(95%CI1.16-10.93)；图3B显示在AJCCI期黑素瘤的试验组中Ambra-1表达的多变量分析。显示在AJCCI期原发性黑素瘤表皮中的7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，其揭示与具有缺乏表皮Ambra-1的I期肿瘤(底线)比较的Ambra-1表达无变化(顶线)。DFS=100%无Ambra-1丧失，83.3%降低或缺乏Ambra-1。对数秩(Mantel-Cox)检验P=0.0575，HR4.29(95%CI0.95-19.25)；图4A是显示在表皮中7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，在所有肿瘤类型中，与其中Ambra-1的表达丧失的那些(底线)比较，在所述表皮中Ambra-1表达维持(顶线)。P=0.0007，HR10.1(95%CI2.65-38.5)；图4B是显示在表皮中7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，在所有肿瘤类型中，与其中兜甲蛋白的表达丧失的那些(底线)比较，在所述表皮中兜甲蛋白表达维持(顶线)。P=0.0006,HR18.4(95%CI3.5-96.2)；图4C是显示在表皮中7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，在所有肿瘤类型中，与其中Ambra-1和兜甲蛋白的表达丧失的那些(底线)比较，在所述表皮中Ambra-1和兜甲蛋白表达均维持(顶线)。P= 0.0001,HR39.6(95%CI6.4-243.9)；图5A是显示在AJCCI期原发性黑素瘤表皮中7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，与其中Ambra-1表达丧失的那些(底线)比较，在所述表皮中Ambra-1表达维持(顶线)。P=0.001,HR24.12(95%CI3.6-161)；图5B是显示在AJCCI期原发性黑素瘤表皮中7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，与其中兜甲蛋白表达丧失的那些(底线)比较，在所述表皮中兜甲蛋白表达维持(顶线)。P 0.0001，HR210(95%CI16.86-2624)；图5C是显示在AJCCI期原发性黑素瘤表皮中7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线，与其中Ambra-1和兜甲蛋白表达丧失的那些(底线)比较，在所述表皮中Ambra-1和兜甲蛋白表达均维持(顶线)。P=0.0002,HR93.5(95%CI8.67-1008)；图6显示来自UniProtKB(主入藏登记号Q9C0C7-1，同工型1)(SEQIDNO.1)的智人Ambra-1的氨基酸序列；和图7显示来自UniProtKB(主入藏登记号P23490)(SEQIDNO.2)的智人兜甲蛋白的氨基酸序列。图8显示Ambra-1(抗-Ambra-1抗体(AbcamBiochemicals,Cambridge,UK；69501；1:200))在正常表皮(a)，或覆盖I期黑素瘤(b)中表达的一系列显微镜图像。Ambra-1维持，(c)。Ambra-1降低和(d)Ambra-1完全丧失。图9显示兜甲蛋白(抗-兜甲蛋白抗体(AbcamBiochemicals,Cambridge,UK；24722；1:500))在正常表皮(a)，或覆盖I期黑素瘤(b)中表达的一系列显微镜图像。兜甲蛋白维持，(c)兜甲蛋白完全丧失。图10显示对肿瘤周围的Ambra-1的变化(无丧失、一些丧失或完全丧失)给出的视觉评分和与肿瘤周围的表皮比较的正常表皮中染色阳性百分比降低的量化分析结果之间的关系。水平线表示均数评分百分比±均数标准误差(0=12.05，1=25.16，3=46.92)。单因素ANOVAP 0.0001****图11显示对肿瘤周围的Ambra-1的变化给出的视觉评分与无丧失或一些丧失染色和完全丧失染色之间的关系。水平线表示均数评分百分比±标准差(无/一些丧失均数=18.12SD12.97，完全丧失均数=46.92SD15.34)。曼-惠特尼秩和检验(Mann-Whitney)P 0.0001****图12显示在全部AJCCI期黑素瘤中表皮Ambra-1表达的单变量分析。显示在无丧失或减少的Ambra-1表达(黑线)，对比缺乏Ambra-1表达(红线)的原发性黑素瘤表皮中的7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线。DFS=97.7%无丧失/降低的Ambra-1(n=44)，94.3%缺乏Ambra-1(n=35)。对数秩(Mantel-Cox)检验P=0.411，HR2.59(95%CI0.26-25.05)。图13显示在全部AJCCI期黑素瘤中表皮Ambra-1和兜甲蛋白的组合表达的单变量分析。显示在维持一些表皮Ambra-1或兜甲蛋白表达(“低风险”黑线)，对比丧失Ambra-1和兜甲蛋白二者的表皮表达(“高风险”红线)的原发性黑素瘤表皮中的7-年无疾病存活(直到检测出首次转移的月份)的卡普兰-迈耶曲线。DFS=98.46%低风险(n=65)，86.67%高风险(n=15)。对数秩(Mantel-Cox)检验P=0.025，HR9.29(95%CI1.49-558.0)。本发明某些实施方案的进一步的细节在下文提供。定义如在此所用的术语\"抗体\"意欲包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源抗体、双-特异性抗体、抗体-药物缀合物，和抗体的结构域和片段，包括Fab、Fab\'、F(ab\')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体(minibodies)、双抗体(diabodies)及其多聚体。抗体可使用常规技术被片段化。抗体可来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物(如，人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马，或鸡)、转基因动物，或来自重组来源。抗体可使用本领域技术人员已知的方法制备。如在此所用的，术语\"原发性黑素瘤\"指在无区域或远处转移性疾病的临床或组织学证据的患者的来源部位的皮肤上的恶性肿瘤，而不管其厚度。如在此所用的，措辞“覆盖原发性黑素瘤的组织”，指位于原发性黑素瘤和皮肤表面之间的表皮组织。如在此所用的，术语“正常组织”包括例如“正常表皮”，其是健康(即无疾病)表皮。在一些实施方案中，正常组织是位于原发性黑素瘤附近的表皮，例如在原发性黑素瘤样本附带的正常皮肤的套囊内。如在此所用的，“肿瘤周围的表皮”指覆盖或位于肿瘤周围的表皮组织。如在此所用的，\"转移\"被定义为可局部(例如局部复发和在转移疾病中)、区域(例如结节微转移或宏转移)，或远端(例如脑、肺和其它组织)发生的复发或疾病进展。在一些实施方案中，术语“转移”被用来指在原发性黑素瘤之后转移的疾病。通常，源自原发性黑素瘤的转移可扩散至受试者的肺和/或脑以及其它位置。要理解如在此所用的术语“比较”和“对比”通常指对应的参数或水平的比较，如绝对量与绝对参考量比较，而浓度与参考浓度比较，或从组织样本获得的信号强度信号与从参考获得的相同类型的信号强度比较。比较可手工进行，例如由视觉评估，或它可自动(如使用自动扫描仪或计算机-辅助装置)进行。因此，比较可用计算设备进行。黑素瘤的阶段分期是其广泛扩散到何种程度的描述。这包括其在皮肤中的厚度，是否它已扩散至附近的淋巴结或任何其它器官，以及某些其它因素。分期是基于物理检查、活组织检查，和任何成像试验(CT或MRI扫描等)或已经进行的其它试验的结果。这样的试验将是本领域技术人员已知的。最常用来对黑素瘤分期的系统是美国癌症联合委员会(AJCC)TNM系统。表1描述鉴定每个阶段的特征。表1实施例材料和方法实施例1对于Ambra-1和兜甲蛋白的免疫组织化学表2中所示的来自患者组的原发性黑素瘤组织的分析通过福尔马林-固定的石蜡-包埋的切片的免疫组织化学染色进行。将5-6μm厚度的组织切片于56℃烘烤到X-tra显微镜载玻片上(LeicaMicrosystems,MiltonKeynes,UK)过夜。然后使它们在Histoclear(AGTCBioproducts,Hessle,UK)中孵育20分钟，然后在100%、75%、50%乙醇中，和然后在蒸馏水中各自再水合5秒。抗原恢复通过在预热抗原恢复缓冲剂中(Ambra-1(10mMTris-HCl(pH7.6))、兜甲蛋白(10mM柠檬酸钠(pH6.0))微波加热12分钟，然后使之冷却20分钟进行。使每个切片干燥并用ImmEdge疏水笔(VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,USA)分离组织。然后使切片与PBS/0.05%吐温(PBS/T)一起孵育3分钟以允许再水合，然后与0.2%TritonX-100(Sigma,St.Louis,USA)一起在PBS/T中孵育10分钟。在用PBS/T洗涤后，使切片在3%H2O/水中孵育10分钟以封闭内源性过氧化物酶。内源性抗生物素蛋白用抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,USA)的抗生物素蛋白溶液封闭15分钟，然后用PBS/T进一步洗涤并与试剂盒的生物素部分一起孵育15分钟，随后用PBS/T洗涤。蛋白封闭通过使切片在来自动物特定VectastainElite试剂盒(VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,USA)的2%封闭血清中孵育来进行。在另外的PBS/T洗涤后，于室温下，使切片用一次抗体以抗-Ambra-1抗体(AbcamBiochemicals,Cambridge,UK；69501；1:200)或抗-兜甲蛋白抗体(AbcamBiochemicals,Cambridge,UK；24722；1:500)一起孵育1小时。用PBS/T洗涤3次后，于室温下，用生物素化动物特异性二次抗体检测一次抗体30分钟，然后用PBS/T进一步洗涤3次。染色通过与来自VectastainElite试剂盒的ABC试剂(预混合30分钟，然后使用)一起孵育30分钟来进行，接着用PBS/T洗涤3次，然后与VIP溶液(VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,USA)一起孵育10分钟。载玻片用自来水淋洗5分钟，然后用苏木精(SigmaDiagnostics,St.Louis,USA)复染色2分钟，接着用频繁更换的自来水洗涤最后10分钟。在通过75%和100%乙醇脱水5秒后，将切片用histoclear清洁2分钟，使之干燥，然后盖玻片用DPX封片剂(VWRInternationalLtd.,Poole,UK)固定。表达的测定正常表皮和肿瘤周围的表皮之间的Ambra-1和/或兜甲蛋白表达水平的差异最初是由3位皮肤科医师和组织病理学家的共识协议确定的。使用LeicaQWin图像分析软件(LeicaMicrosystems)，作为在邻近正常表皮的内部控制参考中测定的Ambra-1/兜甲蛋白表达的百分比，通过评价在肿瘤周围的阳性染色的细胞的百分比量化表达。这些观察被分类为“维持”( 75%的正常表达)、“降低”(25-75%的正常表达)或“丧失”( 25%的正常表达)。进行每个切片的评价，而无需最终的疾病后果的现有知识。表2：患者组患者数129男性:女性66:62诊断时的中位数年龄(范围)58(17-87)诊断时的AJCC阶段1a401b362a222b182c12最终AJCC阶段(8年随访)1a381b272a122b72c4315425中位数布雷斯洛深度(范围)1.55mm(0.3-15)溃烂性原发性肿瘤28统计学所有的统计学分析和图像生成使用GraphPadPrism5(GraphPadSoftware；SanDiego,USA)统计学分析软件进行。用于无疾病存活的研究变量的所有单变量和多变量分析使用卡普兰-迈耶曲线构建针对8-年随访，以及比较数据的对数秩(Mantel-Cox)分析来进行。实施例1结果和讨论本发明人鉴定Ambra-1在覆盖黑素瘤，特别是在AJCCI期黑素瘤的肿瘤周围的表皮中表达的降低，与降低的7年无疾病存活显著相关。如在图1A中所示，在位于AJCCI期黑素瘤邻近的正常表皮中，从基底层朝向角质层，Ambra-1表达增加，与维持分化一致。然而，Ambra-1表达在覆盖一系列AJCCI期肿瘤的表皮中维持(图1B)、降低(图1C)或甚至丧失(图1D)。参照图3，表皮Ambra-1表达的丧失或降低与转移风险增加相关。纵贯全部AJCC黑素瘤(图3A)，显示无丧失的Ambra-1表达的100%患者在7年后无疾病。这在降低或缺乏Ambra-1表达的患者中降低至72.1%。只有35.7%的患有溃烂性黑素瘤的患者在7年后无疾病。这凸显了随着Ambra-1的丧失，疾病风险的逐步增加，并最终伴随肿瘤的明显溃烂。仅举出AJCCI期黑素瘤(图3B)，在7年后无疾病的患者的百分比对于Ambra-1表达无丧失的那些为100%，对于降低或缺乏Ambra-1表达的那些，减少至83.3%。图4A和5A显示较小组中的受试者的Ambra-1表达和无疾病存活之间的相关性，在所述组中对全部肿瘤类型(图4A)或仅对I期(图5A)评价了7年的Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达。纵贯全部肿瘤类型(图4A)，其中Ambra-1的表达维持的全部患者在7年后无疾病。对于其中Ambra-1表达丧失的那些，只有18%在7年后无疾病。对于I期肿瘤，维持Ambra-1的表达的患者的100%再次未有转移发生，而无疾病存活率对于丧失Ambra-1表达的那些是17%。与本领域暗示Ambra-1控制自噬的当前的出版物相反，Ambra-1在本文中的作用被认为是下调正常表皮的分化，导致丧失完整性。本发明人已证实其它自噬蛋白，例如ATG1的下调不影响分化过程，支持这种过程与自噬无关的假设。出乎意料地，发现丧失兜甲蛋白表达也与转移风险增加相关。图2A-C显示正常兜甲蛋白在角质层中表达(图2A)以及在肿瘤周围的表皮中表达(其中兜甲蛋白表达丧失(图2B)或维持(图2C))的代表性图像。参照图4B和5B，表皮兜甲蛋白表达的丧失或降低与7年的无疾病存活降低有关。纵贯全部AJCC黑素瘤(图4B)，兜甲蛋白表达维持的患者的64%在7年后无疾病。然而，丧失兜甲蛋白表达的患者没有在5年后是无疾病的。对于AJCCI期黑素瘤(图5B)，其中兜甲蛋白表达维持的患者的100%在7年后无疾病。丧失兜甲蛋白表达的患者没有在5年后是无疾病的。这证实黑素瘤患者中兜甲蛋白表达和无疾病存活率之间的统计学显著相关。然而，正如Ambra-1，仅丧失兜甲蛋白，对AJCCI期黑素瘤或者对于所有的肿瘤阶段，并不能100%准确地预测疾病进展(见表3)。然而，本发明人已确定Ambra-1和兜甲蛋白二者的表达的测定是疾病进展至转移的强烈指示。这些实验的结果示于图4C和5C中，和在表3中概括。表31阳性预测值2阴性预测值因此，已发现丧失Ambra-1和丧失兜甲蛋白的组合以100%准确性鉴定继续发展转移的患者。实施例2进一步的分析在80个回顾的AJCCI期黑素瘤患者的样本中进行，所述患者从独立的詹姆斯库克大学医院(independentJamesCookUniversityHospital)黑素瘤组中招募(表4)。分析揭示数据符合在上文详述的最初回顾组的结果。表4免疫组织化学染色使用作为在临床应用中最广泛使用的特定染料的DAB复染剂进行。使用纽卡斯尔大学生物样本库(NewcastleUniversityBiobank)内的LeicaSCN400数字玻片扫描仪(LeicaBiosystems)自动扫描载玻片，对所有样本数字成像(图8和9)。表皮Ambra-1丧失的视觉分析由2位独立的皮肤科医师进行，并基于在肿瘤周围的表皮中与相同的切片内的正常表皮比较的丧失表皮Ambra-1的程度，对每个载玻片赋予分值。在皮肤科医师之间给出的评分中有95%的一致性，并且这些载玻片的进一步的检查导致对于每个的一致分数。类似地，相同的两个皮肤科医师独立地进行表皮兜甲蛋白丧失的视觉分析。不是由于外层表皮的直接肿瘤侵袭导致的肿瘤周围表皮的兜甲蛋白染色连续性的任何中断被评分为兜甲蛋白丧失。对所有样本达成97.5%的一致性。表皮Ambra-1的量化分析使用LeicaSlidepath系统的先前验证的分析软件进行。以200x放大倍率选择正常表皮的5个代表性区域并获得DAB阳性像素的平均百分比。将其与在肿瘤周围的表皮的10个代表性区域(200x放大倍率)的DAB阳性像素的平均百分比对比。然后计算在肿瘤周围的表达和正常表皮的表达之间的Ambra-1表达的总百分比降低。视觉和量化评分的比较(图10)揭示了随着视觉分析的肿瘤周围Ambra-1降低，量化评分的统计学显著(P 0.0001)的逐步增加。这证实视觉评分为分析Ambra-1表皮染色的稳健和可靠方法。为确定存活分析的分割点，视觉和量化评分用没有丧失或有一些丧失的肿瘤周围的Ambra-1对比完全丧失来再分析(图11)。这显示在视觉评分的样本中作为具有完全丧失Ambra-1的定性评分的统计学显著的增加(P 0.0001)。这进一步验证了视觉评分鉴定具有完全丧失的肿瘤周围Ambra-1的样本的适宜性，和低于完全Ambra-1丧失的均值的一个标准差(46.92均值SD15.34)给出30%的适宜截止，以确定Ambra-1丧失的进一步的定性分析。全部患者中肿瘤周围的Ambra-1丧失的单变量分析揭示在“高风险”(具有肿瘤周围的Ambra-1完全丧失的肿瘤，如通过表达的定性降低 30%所确定的)和“低风险”肿瘤(定性表达降低 30%)之间的无疾病生存没有总体差异(图5)。DFS=97.7%低风险肿瘤(n=44)，94.3%高风险肿瘤(n=35)。对数秩(Mantel-Cox)检验P=0.411，HR2.59(95%CI0.26-25.05)。这些结果不支持Ambra-1作为在这个亚组患者中的预后的生物标志。为评估表皮Ambra-1和兜甲蛋白表达作为预后的生物标志的组合的有效性，在所有的样本中采用单变量分析。“高风险”样本被鉴定为具有完全肿瘤周围的Ambra-1丧失( 30%的定量降低)和丧失兜甲蛋白。具有丧失Ambra-1或者丧失兜甲蛋白的全部其它肿瘤被认为是“低风险”的。这些结果显示在高风险肿瘤组中转移的统计学显著增加的风险，即使转移事件的总数是低的；进一步增强了Ambra-1和兜甲蛋白的组合作为组合预后生物标志在AJCCI期疾病中的用途。DFS=98.46%低风险(n=65)，86.67%高风险(n=15)。对数秩(Mantel-Cox)检验P=0.025，HR9.29(95%CI1.49-558.0)。表5组合的Ambra-1/兜甲蛋白生物标志的最终分析强调了增加的特异性(83%)，组合的Ambra-1/兜甲蛋白的阳性和阴性预测值(分别为13%和98.4%)超过和高于单独的Ambra-1或者兜甲蛋白(表5)。这表示组合的生物标志将在更确定地鉴定高风险患者以增加监视，以及鉴定低风险患者(所述患者可被打消关于他们的预后的疑虑)中增加预后价值。这是一个重要的发现，因为这两种蛋白的表达的降低或丧失可表示覆盖肿瘤的表皮和肿瘤下面的血管的分解，意味着癌细胞可能在肿瘤切除时已经从原发性肿瘤转移。因此，本发明的某些实施方案提供一种确定罹患黑素瘤的受试者是否处于增加的转移风险中的方法。这允许相应定制治疗方案，从而减少受试者发生转移的风险并改善其预后。纵贯本申请的说明书和权利要求书，单词“包含”和“包括”及其变化意指“包括但不限于”并且它们不打算(且不)排除其它部分、添加物、组分、整数或步骤。纵贯本申请的说明书和权利要求书，单数涵盖复数，除非上下文另有要求。特别是，当使用不定冠词时，本申请应被理解为涵盖复数以及单数，除非上下文另有要求。结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特性、整数、特征或组，应被理解为适用于在此描述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不适配。本申请公开的全部特征(包括任何所附的权利要求书、摘要和附图)，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以任何组合合并，除了其中至少一些特征和/或步骤相互排斥的组合外。本发明不限于任何前述实施方案的任何细节。本发明扩展至本申请中公开的任何新的特征，或新的特征组合(包括任何所附的权利要求书、摘要和附图)，或扩展至如此公开的任何方法或过程的任何新的步骤，或任何新的步骤组合。读者的注意涉及全部论文和文件，所述论文和文件结合本申请与本说明书同时提交或在本说明书之前提交，并且与本说明书一起向公众检查公开，而所有这样的论文和文件的内容通过引用结合到本文中。当前第1页1 2 3